Criopreservação de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo: Uma alternativa para lipoenxertia seriada na reconstrução mamária / Cryopreservation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: An alternative to serial fat grafting in breast reconstruction

Introdução: A lipoenxertia é um enxerto autólogo de células do tecido celular subcutâneo, que pode ser utilizada como técnica complementar na reconstrução mamária. Diante disso, a criopreservação de células-tronco mesenquimais provenientes de tecido adiposo (CTDAs) poderia ser uma maneira de realizar a coleta em um tempo cirúrgico e após realizar a lipoenxertia de forma fracionada. O dimetilsulfóxido (DMSO) é um criopreservante utilizado em pesquisas com células, porém é potencialmente tóxico, o que impossibilitaria a utilização de CTDAs criopreservadas na prática clínica. Novos criopreservantes celulares, sem toxicidade, vêm sendo descritos na literatura científica experimental, como as substâncias L-prolina e trealose. Com isso, esse trabalho teve como objetivo avaliar a viabilidade de CTDAs criopreservadas com a combinação de L-prolina e trealose, em um período de até 90 dias. Método: Estudo experimental, no qual foram obtidas amostras de lipoaspirado provenientes de 9 pacientes. A fração celular foi processada e congelada com L-prolina (1,5M) + trealose (0,2M), ou com DMSO + soro fetal bovino (SFB), como controle. Após 30 e 90 dias, as amostras foram descongeladas e a viabilidade celular foi avaliada pela técnica de MTT. Resultados: A análise das CTDAs, após 1 e 3 meses de congelamento, indicou que as amostras tratadas com L-prolina + trealose apresentaram viabilidade semelhante àquelas preservadas com DMSO e SFB (p=0,444). Conclusão: A associação de L-prolina e trealose manteve CTDA viáveis por 30 e 90 dias de congelamento, podendo ser uma alternativa como criopreservante celular sem toxicidade e viabilizando o uso de lipoenxertia seriada.

Introduction: Fat grafting is an autologous graft of cells from subcutaneous tissue, which can be used as a complementary technique in breast reconstruction. Given this, the cryopreservation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) could be a way to collect them in one surgical procedure and after performing fractional fat grafting. Dimethyl sulfoxide (DMSO) is a cryopreservative used in cell research, but it is potentially toxic, which would make it impossible to use cryopreserved ADMSCs in clinical practice. New cellular cryopreservatives, without toxicity, have been described in the experimental scientific literature, such as the substances L-proline and trehalose. Therefore, this work aimed to evaluate the viability of ADMSCs cryopreserved with the combination of L-proline and trehalose over up to 90 days. Method: Experimental study in which lipoaspirate samples were obtained from 9 patients. The cellular fraction was processed and frozen with L-proline (1.5M) + trehalose (0.2M) or with DMSO + fetal bovine serum (FBS) as control. After 30 and 90 days, the samples were thawed, and cell viability was assessed using the MTT technique. Results: The analysis of ADMSCs, after 1 and 3 months of freezing, indicated that samples treated with L-proline + trehalose showed similar viability to those preserved with DMSO and SFB (p=0.444). Conclusion: The association of L-proline and trehalose kept ADMSC viable for 30 and 90 days of freezing, and could be an alternative as a cellular cryopreservative without toxicity and enabling the use of serial fat grafting.

Mesenchymal cells in rotator cuff repair - technique description and case reports / Células mesenquimais no reparo da rotura do manguito rotador - descrição de técnica e relato de casos

ABSTRACT Objective: To describe a protocol of obtention of mesenchymal stem cells and to report their use as a biological adjuvant in three patients undergoing arthroscopic rotator cuff repair. Methods: Case series of patients who underwent arthroscopic repair of isolated full-thickness supraspinatus tear using mesenchymal stem cells obtained from the bone marrow as a biological adjuvant. All patients were operated on at the same institution, by a surgeon with 13 years of experience. The cells were applied at the end of the procedure, at the tendon-bone interface, at an approximate concentration of 2,000,000 mesenchymal cells/mm3 and a total volume of 5 ml. Results: All patients improved with the procedure, with one excellent and two good results. All cases overcame the minimally important clinical difference. All cases reached tendon healing, without partial or complete re-tears. We observed no complications. Conclusion: Arthroscopic rotator cuff repair with added mesenchymal cells obtained from bone marrow and submitted to a cell expansion process led to good functional results and healing in all cases in the sample, with no complications. Level of Evidence IV, Case Series.

RESUMO Objetivo: Descrever o protocolo de obtenção de células mesenquimais e relatar seu uso como adjuvante biológico em três pacientes submetidos ao reparo artroscópico do manguito rotador. Métodos: Série de casos de pacientes submetidos ao reparo artroscópico de rotura transfixante do músculo supraespinal utilizando como adjuvante biológico células mesenquimais obtidas da medula óssea. Todos ospacientes foram operados na mesma instituição por um cirurgião com 13 anos de experiência. As células foram aplicadas ao final do procedimento, na interface do tendão com o osso, na concentração aproximada de 2 milhões de células mesenquimais/mm3 e volume total de 5 ml. Resultados: Todos os pacientes melhoraram após o procedimento, havendo um resultado excelente e dois bons. Todos superaram a diferença clínica minimamente importante. Em todos os casos ocorreu cicatrização tendínea, sem a presença de rerroturas parciais ou completas. Não observamos complicações. Conclusão: O reparo do manguito rotador artroscópico com adição de células mesenquimais obtidas da medula óssea e submetidas a processo de expansão celular levou a bons resultados funcionais e cicatrização, sem complicações, em todos os casos da amostra. Nível de Evidência IV, Série de Casos.

Impact of Hyaluronic Acid on the Viability of Mesenchymal Cells Derived from Adipose Tissue Grown in Collagen Type I/III Membrane / Impacto do ácido hialurônico na viabilidade das células mesenquimais derivadas do tecido adiposo cultivadas em membrana de colágeno tipo I/III

Abstract Objective To evaluate in vitro the viability of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (AD-MSCs) in different commercial solutions of hyaluronic acid (HA) before and after being sowed in collagen I/III membrane. Methods In the first stage, the interaction between AD-MSCs was analyzed with seven different commercial products of HA, phosphate buffered saline (PBS), and bovine fetal serum (BFS), performed by counting living and dead cells after 24, 48 and 72 hours. Five products with a higher number of living cells were selected and the interaction between HA with AD-MSCs and type I/III collagen membrane was evaluated by counting living and dead cells in the same time interval (24, 48 and 72 hours). Results In both situations analyzed (HA + AD-MSCs and HA + AD-MSCs + membrane), BFS presented the highest percentage of living cells after 24, 48 and 72 hours, a result higher than that of HA. Conclusion The association of HA with AD-MSCs, with or without membrane, showed no superiority in cell viability when compared with BFS.

Resumo Objetivo Avaliar in vitro a viabilidade das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AD-CTMs) em diferentes soluções comerciais de ácido hialurônico (AH) antes e após serem semeadas em membrana de colágeno I/III. Métodos Na primeira etapa, analisou-se a interação entre AD-CTMs com sete diferentes produtos comerciais de AH, salina tamponada com fosfato (PBS, na sigla em inglês) e soro fetal bovino (SFB), realizada pela contagem das células vivas e mortas após 24, 48 e 72 horas. Foram selecionados cinco produtos com maior número de células vivas e avaliou-se a interação entre o AH com AD-CTMs e a membrana de colágeno tipo I/III pela contagem de células vivas e mortas no mesmo intervalo de tempo (24, 48 e 72 horas). Resultados Em ambas as situações analisadas (AH + AD-CTM e AH + AD-CTM + membrana), o SFB apresentou a maior porcentagem de células vivas após 24, 48 e 72 horas, resultado superior ao do AH. Conclusão A associação do AH com as AD-CTMs, com ou sem a membrana, não demonstrou superioridade na viabilidade celular quando comparado com SFB.

Treatment of Muscle Injury with Stem Cells - Experimental Study in Rabbits / Tratamento da lesão muscular com células-tronco - Estudo experimental em coelhos

Abstract Objective Histological and macroscopic evaluation of the healing process of acute lesions of the femoral rectus muscle using stem cells derived from adipose tissue-derived stem cells (ADSCs). Method An experimental study was conducted with 18 hind legs of New Zealand rabbits, which were divided into three study groups according to the intervention to be performed. In group I, no surgical procedure was performed; in group II—SHAN, the experimental lesion was performed without any additional intervention protocol; in group III—Intervention, the addition of ADSCs was performed in the same topography of the experimental lesion. After the proposed period, 2 weeks, the material was collected and submitted to macroscopic and histological evaluation. Results The quantitative analysis showed that the addition of ADSCs is related to the reduction of inflammatory cells in the 2-week evaluation (164.2 cells in group II - SHAN to 89.62 cells in group III - ADSC). The qualitative analysis of the slides with Picrosirius red, noticed an increase in orange/yellow fibers in group III - ADSC, which evidences a final healing process. The macroscopic evaluation found no difference between the groups. Conclusion The use of ADSCs in the treatment of acute muscle injury presented histological advantages when compared to their non-use.

Resumo Objetivo Avaliação histológica e macroscópica do processo de cicatrização das lesões agudas do músculo reto femoral, com utilização de células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs, na sigla em inglês). Método Foi realizado um estudo experimental com 18 patas traseiras de coelhos Nova Zelândia, que foram divididos em três nos grupos de estudo de acordo com a intervenção a ser realizada. No grupo I não foi realizado procedimento cirúrgico; no grupo II - SHAN foi realizado a lesão experimental sem nenhum protocolo de intervenção adicional; e no grupo III - Intervenção foi realizado a adição de ADSCs na mesma topografia onde foi realizada a lesão experimental. Após o período proposto, 2 semanas, o material foi coletado, submetido a avaliação macroscópica e histológica. Resultados A análise quantitativa demonstrou que a adição de ADSCs está relacionada com a diminuição de células inflamatórias na avaliação com 2 semanas (164,2 células no grupo II - SHAN para 89,62 células no grupo III - ADSC). A análise qualitativa das lâminas coradas com Picrosírius red demonstrou um aumento das fibras de cor laranja/amarela no grupo III - ADSC, o que evidencia um processo final de cicatrização. A avaliação macroscópica não encontrou diferença entre os grupos. Conclusão A utilização de ADSCs no tratamento de lesão muscular aguda apresentou vantagens histológicas quando comparada a sua não utilização.

BMP-4, TGF-β and Smad3 as Modulators of Synovial Fluid Cells Viability / BMP-4, TGF-β e Smad3 como moduladores da viabilidade das células do líquido sinovial

Abstract Objective Our goal was to evaluate the modulation of the synovial fluid cells (SFC) from patients with and without osteoarthritis (OA) by bone morphogenetic protein 4 (BMP-4), Smad-3 and transforming growth factor beta (TGF-β). Methods Synovial fluid was collected from patients submitted to knee arthroscopy or replacement and were centrifuged to isolate cells from the fluid. Cells were cultured for 21 days and characterized as mesenchymal stem cells (MSCs) according to the criteria of the International Society of Cell Therapy. Then, we performed an [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay (MTT) assay after exposing cells with and without OA to TGF-β, Smad3 and BMP-4 pathway inhibitors and to different concentrations of BMP4. Results Exposure to the TGF-β, Smad3 and BMP-4 inhibitors modifies the mitochondrial activity of the SFCs. The activity of the SFCs is modified by influences of increasing concentrations of BMP4, but there is no difference in cellular activity between patients with and without OA. Conclusion TGF-β, Smad3 and BMP-4 modulate the activity of SFCs from patients with and without knee OA.

Resumo Objetivo Nosso objetivo foi avaliar a modulação das células do líquido sinovial (SFCs, na sigla em inglês) de pacientes com e sem osteoartrite (OA) por proteína morfogenética óssea 4 (BMP-4), Smad3 e transformador do fator de crescimento β (TGF-β). Métodos O do líquido sinovial foi coletado de pacientes submetidos a artroscopia ou artroplastia do joelho, e centrifugados para isolar as células do liquido sinovial. As células foram cultivadas por 21 dias e caracterizadas como células-tronco mesenquimais (MSCs, na sigla em inglês) de acordo com os critérios da International Society of Cell Therapy. Em seguida, realizamos um ensaio de brometo de 3-4,5-dimetil-tiazol-2-il-2,5difeniltetrazólio (MTT) depois de expor células com e sem OA para TGF-β, inibidores de via Smad3 e BMP-4 e para diferentes concentrações de BMP-4. Resultados A exposição aos inibidores TGF-β, Smad3 e BMP-4 modifica a atividade mitocondrial das SFCs. A atividade das SFCs é modificada por influências sobre o aumento das concentrações de BMP-4, mas não há diferença na atividade celular entre pacientes com e sem OA. Conclusão TGF-β, Smad3 e BMP-4 modulam a atividade das SFCs de pacientes com e sem OA do joelho.

Enxerto de Gordura Prévio e Transplante pela Técnica FUE em Cicatrizes do Couro Cabeludo: Atualização / Previous fat grafting and hair transplantation using the FUE technique on scalp scars: Update

Foi realizada uma revisão de literatura narrativa, sobre a associação de enxerto de gordura e transplante de cabelos com a técnica FUE (Follicular Unit Extraction) em cicatrizes do couro cabeludo. Os dados foram coletados a partir de estudos encontrados nas bases Medline, Lilacs e IBECS. Foram citados registros bibliográficos de vários autores que pesquisaram as células mesenquimais do tecido gorduroso, com descrição das técnicas utilizadas. A conclusão foi de que a técnica de transplante capilar em duas etapas, com transplante prévio de gordura é eficaz, segundo os artigos revisados.

We developed a narrative literature review on the association of fat grafting and hair transplantation using the Follicular Unit Extraction (FUE) technique in scalp scars. Data were collected from studies found in Medline, Lilacs, and IBECS databases. Bibliographical records of several authors who researched mesenchymal cells in adipose tissue were cited, describing the techniques used. The conclusion was that the two-stage hair transplantation technique, with previous fat transplantation, is effective, according to the reviewed articles.

Identification of new human mesenchymal stem cell biomarker by aptamers / Identificação de novos biomarcadores de células tronco mesenquimais de origem humana por meio de aptâmeros

Stem cells are undifferentiated cells that can be distinguished from others by their ability to self-renew and to differentiate into new specific cell types. Mesenchymal stem cells (MSC) are adult stem cells that can be obtained from different sources, such as adipose tissue, bone marrow, dental pulp, and umbilical cord. They can either replicate, originating new identical cells, or differentiate into cells of mesodermal origin and from other germ layers. MSC have been studied as new tools for regenerative therapy. Although encouraging results have been demonstrated, MSC-based therapies still face a great barrier: the difficulty of isolating these cells from heterogeneous environments. MSC are currently characterized by immunolabelling through a set of multiple surface membrane markers, including CD29, CD73, CD90 and CD105, which are also expressed by other cell types. Hence, the present work aimed to identify new specific biomarkers for the characterization of human MSC using DNA aptamers produced by the SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) technique. Our results showed that MSC from different origins bound to DNA candidate aptamers, that is, DNA or RNA oligonucleotides selected from random libraries that bind specifically to biological targets. Aptamer-bound MSC could be isolated by fluorescenceactivated cell sorting (FACS) procedures, enhancing the induction of differentiation into specific phenotypes (chondrocytes, osteocytes and adipocytes) when compared to the whole MSC population. Flow cytometry analyses revealed that candidate aptamers bound to 50% of the MSC population from dental pulp and did not present significant binding rates to human fibroblasts or lymphocytes, both used as negative control. Moreover, immunofluorescence images and confocal analyses revealed staining of MSC by aptamers localized in the surfacemembrane of these cells. The results also showed internal staining of human monocytes by our investigated aptamers. A non-specific control aptamer (CNTR APT) obtained from the random pool was then utilized to compare the specificity of the aptamers bound to the analyzed non-apoptotic cells, showing no staining for MSC. However, 40% of the monocytes bound to the CNTR APT. Normalized data based on the cells bound to candidate aptamers compared to those bound to the CNTR APT, revealed a 10 to 16-fold higher binding rate for MSC against 2-fold for monocytes. Despite its low specificity, monocyte-aptamer binding occurs probably due to the expression of shared markers with MSC, since monocytes are derived from hematopoietic stem cells and are important for the immune system ability to internalize/phagocyte external molecules. Given that, we performed a pull-down assay followed by mass spectrometry analysis to detect which MSC-specific protein or other target epitope not coexpressed by monocytes or the CNTR APT would bind to the candidate aptamer. Distinguishing between MSC and monocyte epitopes is important, as both cells are involved in immunomodulatory effects after MSC transplantations. ADAM17 was found to be a target of the APT10, emerging as a possible biomarker of MSC, since its involvement in the inhibition of the TGF signaling cascade, which is responsible for the differentiation of MSC. Thus, MSC with a higher stemness profile should overexpress the protein ADAM17, which presents a catalytic site with affinity to APT10. Another target of Apt 10 is VAMP3, belonging to a transmembrane protein complex that is involved in endocytosis and exocytosis processes during immune and inflammatory responses. Overall, proteins identified as targets of APT10 may be cell surface MSC biomarkers, with importance for MSC-based cell and immune therapies

Células tronco são células indiferenciadas que podem ser distinguidas de outros tipos celulares por meio da habilidade de se auto renovarem e de se diferenciarem em novos tipos celulares. Células tronco mesenquimais (MSC) são células tronco adultas encontradas em diferentes tecidos como tecido adiposo, polpa de dente e cordão umbilical. Estas células podem se autodividir em células idênticas ou se diferenciarem em células de origem mesodermal. Estas células têm sido estudadas em novas aplicações que envolvem terapia regenerativas. Embora resultados encorajadores tenham sido demonstrados, terapias que utilizam MSC ainda encontram uma grande barreira: a dificuldade no isolamento destas células a partir de um ambiente heterogêneo. MSC são caracterizadas por populações positivas em ensaios de imunomarcação para os epítopos membranares CD29, CD73, CD90 e CD105, presentes também em outros tipos celulares. Assim, o presente trabalho tem o objetivo de identificar novos biomarcadores de MSC de origem humana, utilizando aptâmeros de DNA produzidos pela técnica SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) como ferramenta. Nossos resultados mostraram que MSC de diferentes origens ligam-se a aptâmeros (oligonucleotídeos de DNA ou RNA que atuam como ligantes específicos de alvos moleculares) de DNA candidatos que atuam no isolamento de MSC por meio da técnica FACS de separação celular, promovendo uma maior indução de diferenciação em células específicas (condrócitos, osteócitos e adipócitos) comparada com a população total de MSC. Análises de citometria de fluxo mostraram que os aptâmeros candidatos se ligam a 50% das MSC de polpa de dente e não apresentam taxa de ligação significante para fibroblastos e linfócitos de origem humana - utilizados como controles negativo. Além domais, imagens de imunofluorescência e confocal mostraram ligação na superfície da membrana de MSC e a marcação interna de monócitos a estes aptâmeros. Portanto, um aptâmero controle (CNTR APT) foi utilizado para comparar a especificidade dos aptâmeros ligados a células viáveis, mostrando a não ligação deste aptâmero a MSC. Porém, 40% da população de monócitos ligou-se ao CNTR APT. Uma normalização baseada na comparação entre as taxas de ligação entre células ligadas com aptâmeros candidatos e o aptâmero controle gerou uma taxa de especificidade entre 10-16 vezes maior para MSC contra 2,5 vezes para os monócitos. Deste modo, embora os resultados tenham mostrado uma taxa de ligação entre monócitos e aptâmeros, as MSC ligadas aos aptâmeros candidatos possuem uma maior taxa de especificidade devido a uma maior presença de antígenos que são expressos em ambas as células. Um ensaio de Pull Down seguido de espectrometria de massas foi utilizado para a identificação de biomarcadores que se ligariam aos aptâmeros candidatos, e que não seriam co-expressos por monócitos e por antígenos ligados ao aptâmero controle. Deste modo, a proteína ADAM17 foi identificada nas amostras de APT10 ligadas às MSC. Tal proteína está relacionada à inibição de uma cascata de sinalização da família de proteínas TGF, responsável pela diferenciação de MSC. Assim, MSC com maior potencial tronco deveriam expressar ADAM17 em maior quantidade. Tal proteína apresenta um sítio catalítico que demonstra interagir com o APT10, de acordo com predição Docking entre proteína e DNA. Foi identificada também, a proteína VAMP3, que pertence a um complexo proteico transmembranar responsável pelos processos de endocitose e exocitose, e que podem ter um papel importante na liberação de citocinas e outras moléculas relacionadas às respostas imune e inflamatórias. Deste modo, o APT10 identificou proteínas importantes que devem estar relacionas com a melhora de imunoterapias que utilizam MSC

Citotoxicidade, genotoxicidade e expressão gênica em células-tronco mesenquimais expostas a materiais endodônticos / Cytotoxicity, genotoxicity and gene expression in mesenchymal stem cells exposed to endodontic cements

No mercado encontramos uma grande variedade de materiais endodônticos disponibilizados para uso clínico, mas diversos estudos mostram divergências de opiniões com relação ao comportamento biológico dos diferentes materiais. Este trabalho teve como objetivos investigar a viabilidade celular, a expressão de genes envolvidos na plasticidade celular e a diferenciação celular em culturas de células- tronco recuperadas de polpa dentária humana (hDPSCs) quando em contato com quatro materiais endodônticos (Endofill, Pulp Canal Sealer, Sealer 26, MTA) rotineiramente utilizados na clínica odontológica. Objetivou também, por meio de uma revisão sistemática, analisar a biocompatibilidade de cimentos de uso endodôntico sobre células tronco de origem dental. Para isto, o metabolismo celular das hDPSCs, quando em contato com os capilares contendo ou não os cimentos, foi avaliado pelo ensaio de MTT (24 e 48 horas) e a viabilidade celular foi analisada pelo ensaio de exclusão do azul de tripan (48 horas). A plasticidade celular, na presença dos capilares contendo ou não os cimentos, foi avaliada pela expressão gênica dos marcadores CD34, CD45, Nestin, CD105, Nanog e OCT-4 por PCR. Finalmente, a diferenciação celular frente aos cimentos endodônticos foi verificada pela expressão dos genes RUNX2, ALP, OC/BGLAP e DMP1 por RT-PCR. Os dados foram analisados pelo teste ANOVA com correção de Bonferroni (p<0.05). Observou-se que os cimentos Pulp Canal Sealer e o Endofill reduziram significativamente a viabilidade e o metabolismo celular quando comparados ao controle após 48 horas (p<0.001). O MTA e o Sealer 26 não interferiram na viabilidade celular em ambos os períodos de avaliação (p>0.05). As hDPSCs, quando cultivadas na presença do MTA e Sealer 26, expressaram os marcadores Nestin, CD105, NANOG e OCT-4, e não expressaram CD34 e CD45. Por sua vez, o MTA e o Sealer 26 interferiram positivamente ou negativamente na expressão gênica de DMP1, OC/BGLAP e RUNX2 em relação ao grupo controle (p<0.05), mas não houve diferença significativa em relação à expressão gênica de ALP (p>0.05). Portanto, MTA e Sealer 26 demonstram boa compatibilidade biológica quando na presença das hDPSCs. A revisão sistemática demonstrou que a maioria dos materiais, apresentam boa compatibilidade quando em contato com as células tronco, estando aptos a serem utilizados na prática clínica.

On the market, we found a wide variety of endodontics cements available for clinical use, but several studies show divergences of opinion regarding the biological behavior of these different materials. This work aimed to investigate cell viability and metabolism, an expression of genes involved in cell plasticity and cell differentiation in stem cell cultures recovered from human dental pulp (hDPSCs) when in contact with four endodontic cements (Endofill, MTA, Pulp Canal Sealer, Sealer 26) routinely used in endodontic clinic. It also aimed, through a systematic review, to analyze the biocompatibility of endodontic materials on dental stem cells. For this, the viability and metabolism of hDPSCs, when it comes into contact with capillaries that included or not cements, was assessed by MTT assay (24 and 48 hours) and exclusion of trypan blue assay (48 hours). Cellular plasticity, with the presence of capillaries containing or not sealers, was evaluated by the genetic expression of the markers CD34, CD45, Nestin, CD105, Nanog and OCT-4 by PCR. Finally, cell differentiation from endodontics sealers was verified by the expression of the RUNX2, ALP, OC/BGLAP and DMP1 genes by RT-PCR. The data were analyzed using the ANOVA test with Bonferroni correction (p<0.05). We note that Pulp Canal Sealer and Endofill sealers decrease cell viability and cellular metabolism when compared to control after 48 hours (p<0.001). MTA and Sealer 26 did not interfere with cell viability in the two evaluation periods (p>0.05). hDPSCs, when grown in the presence of MTA and Sealer 26, express the Nestin, CD105, NANOG and OCT-4 markers, and do not express CD34 and CD45. In turn, MTA and Sealer 26 interfered in the gene expression of DMP1, OC/BGLAP and RUNX2 in relation to the control group (p<0.05), but did not find a significant difference in relation to the ALP gene expression (p>0.05). Therefore, MTA and Sealer 26 demonstrate good biological compatibility when in the presence of hDPSCs. The systematic review showed that almost all materials have good compatibility when in contact with stem cells, being able to be used in clinical practice.

Establecimiento e implementación de un protocolo simplificado de expansión y cultivo de Células Madre de Pulpa Dental Humana (DPSCh) / Estabelecimento e implementação de um protocolo simplificado para expansão e cultura de células-tronco da polpa dentária humana (DPSCh) / Establishing and implementing a simplified protocol for the expansion and culture of human dental pulp stem cells (hDPSCs)

Resumen Objetivos: Establecer e implementar un protocolo simplificado de extracción, aislamiento primario y cultivo de células madre derivadas de la pulpa dental humana (DPSCh). Analizar cuantitativamente y cualitativamente las células aisladas. Metodología: 10 terceros molares sanos donados por pacientes que concurrieron a la Facultad de Odontología, UdelaR y otorgaron su consentimiento escrito fueron procesados antes de las 48 hs. Se realizó la fractura de la pieza para la obtención del tejido pulpar y se procesó por el método explante. Se analizó viabilidad celular y expresión de marcadores por citometría de flujo en pasajes 4 y 12 y se corroboró mediante inmunocitoquímica. Resultados: Las células obtenidas presentaron una vitalidad mayor al 90% en todos los pasajes, observándose una morfología característica y expresión de marcadores de células madre mesenquimales CD90, C105, CD73, CD29 y 166 mediante citometría de flujo en ambos pasajes. Conclusiones: Se logró establecer un protocolo de aislamiento y expansión celular, con alta tasa de éxito de una población de DPSCh.

Resumo Objetivos: Estabelecer e implementar um protocolo simplificado para a extração, isolamento primário e cultura de células-tronco da polpa dentária humana (DPSCh). Analise as células isoladas quantitativa e qualitativamente. Metodologia: 10 terceiros molares saudáveis ​​doados por pacientes que frequentaram a Faculdade de Odontologia UdelaR e deram consentimento por escrito foram processados ​​antes de 48 horas. A fratura da peça foi realizada para obtenção do tecido pulpar e processada pelo método do explante. A viabilidade celular e a expressão do marcador foram analisadas por citometría de fluxo nas passagens 4 e 12 e confirmadas por inmunocitoquímica. Resultados: As células obtidas apresentaram viabilidade superior a 90% em todas as passagens, observando uma morfologia característica e expressão dos marcadores de células-tronco mesenquimais CD90, C105, CD73, CD29 e 166 por citometría de fluxo em ambas as passagens. Conclusões: Foi possível estabelecer um protocolo de isolamento celular, com alta taxa de sucesso e segurança para isolar o DPSCh.

Abstract Objectives: To establish and implement a simplified protocol for the extraction, primary isolation, and culture of human dental pulp stem cells (hDPSCs). To analyze the isolated cells quantitatively and qualitatively. Methodology: Ten healthy third molars were donated by patients who attended the School of Dentistry, UdelaR, and gave their written consent. The teeth were processed within 48 hours. The teeth were sectioned to obtain the pulp tissue and processed with the explant method. Cell viability and marker expression were analyzed by flow cytometry at passages 4 and 12 and verified by immunocytochemistry. Results: The cells obtained had a vitality greater than 90% in all passages. We found the characteristic morphology and the expression of CD90, C105, CD73, CD29 and 166 mesenchymal stem cell markers by flow cytometry in both passages. Conclusion: It was possible to establish a cell isolation protocol that is highly successful and safe to isolate hDPSC.

Adult mesenchymal stem cells and their possibilities for Dentistry: what to expect?

ABSTRACT Introduction: Stem cells obtained from the pulp of human deciduous teeth are highly proliferative and plastic multipotent cells, which makes them a relevant model of stem cells, applied in several biomedical areas, with different purposes. Objective: Based on a brief review of the literature, the present work intends to present from conceptual aspects about stem cells, classifications, potential (in vitro and in vivo) applications in dental practice, cell culture, cryopreservation and its importance, ethical and regulatory aspects, as well as the role of the dental surgeon as the endorser responsible for the entire clinical stage that involves the process of collecting stem cells obtained from dental pulps for cryopreservation, with a view to using them under appropriate conditions, in accordance with scientifically proven and justified good laboratory and clinical practices.

RESUMO Introdução: As células-tronco obtidas a partir da polpa de dentes decíduos humanos são células multipotentes altamente proliferativas e plásticas, o que as torna um modelo relevante de células-tronco, aplicado em diversas áreas biomédicas, com diferentes propósitos. Objetivo: A partir de uma breve revisão da literatura, o presente trabalho pretende apresentar desde aspectos conceituais acerca das células-tronco, classificações, potenciais aplicações (in vitro e in vivo) na prática odontológica, cultivo celular, criopreservação e sua importância, aspectos éticos e regulatórios, bem como o papel do cirurgião-dentista como homologador responsável por toda a etapa clínica que envolve o processo de coleta das células-tronco obtidas a partir de polpas dentais para criopreservação, com vistas ao uso em condições adequadas, em acordo com as boas práticas laboratoriais e clínicas cientificamente comprovadas e justificadas.

Comparison of senescence progression in mesenchymal cells from human umbilical cord walls measured by immunofluorescence and flow cytometry of p16 and p21 / Comparação da progressão da senescência em células mesenquimais de parede de cordão umbilical humano medida por imunofluorescência e citometria de fluxo de p16 e p21

ABSTRACT Objective To follow the expansion of mesenchymal stem cells from umbilical cords by two classic senescence markers, p16 (INK4A) and p21 (CDKN1A), using practical, fast, and less expensive methods than the gold standard Western blotting technique, to evaluate its applicability in the laboratory. Methods Mesenchymal stem cells from umbilical cords were isolated from Wharton's jelly and, after quality control, morphological and immunophenotypic characterization by flow cytometry, were expanded in culture until coming close to cell cycle arrest (replicative senescence). Results A comparison was made between young cells, at passage 5, and pre-senescent cells, at passage 10, evaluating the protein expression of the classic cell senescence markers p16 and p21, comparing the results obtained by Western blotting with those obtained by flow cytometry and indirect immunofluorescence. Conclusion Follow-up of cell cultures, through indirect p16 immunofluorescence, allows the identification of mesenchymal stem cells from umbilical cord cultures at risk of reaching replicative senescence.

RESUMO Objetivo Acompanhar a expansão de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical por dois marcadores clássicos de senescência, p16 (INK4A) e p21 (CDKN1A), usando métodos práticos, rápidos e com custo menor do que a técnica padrão-ouro de Western blotting, para avaliar sua aplicabilidade em laboratório. Métodos Células-tronco mesenquimais de cordão umbilical foram isoladas da geleia de Wharton e, após controle de qualidade e caracterização morfológica e imunofenotípica por citometria de fluxo, foram expandidas em cultura, até chegarem próximas à parada do ciclo celular (senescência replicativa). Resultados Foi feita a comparação entre células jovens, na passagem 5, e células pré-senescentes, na passagem 10, avaliando a expressão proteica dos marcadores clássicos de senescência celular p16 e p21, comparando os resultados obtidos por Western blotting com os obtidos por citometria de fluxo e imunofluorescência indireta. Conclusão O seguimento de culturas celulares, por meio da imunofluorescência indireta de p16, permite identificar as culturas de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical em risco de atingirem a senescência replicativa.

Criopreservação de células-tronco de origem dentária: uma revisão de literatura / Cryopreservation of stem cells of dental origin:a literature review

Introdução: Os tecidos dentários são uma fonte acessível de células--tronco mesenquimais que podem ser úteis para o tratamento de va-riadas doenças clínicas. Logo, o interesse e a necessidade de garantir uma forma eficaz de conservar as células-tronco de origem dentá-ria para aplicações futuras levou ao desenvolvimento de métodos de criopreservação, técnica pela qual são aplicadas baixas tempe raturas para cessar de maneira reversível e controlada as funções biológicas de células e tecidos vivos. Objetivo: Realizar uma revisão de literatura acerca da criopreservação de células-tronco de origem dentária, enfatizando características, princípios, protocolos existen-tes e efeitos desse método às propriedades biológicas dessas células. Metodologia: Este estudo constituiu numa revisão de literatura com base nas informações de 54 artigos científicos publicados no período entre 2005 e 2019 e consultados em bases de dados on-line (Pub-Med, SciELO e Google Acadêmico), com a utilização dos seguin-tes descritores: Criopreservação (Cryopreservation), Células-tronco dentárias (Dental stem cells) e Criopreservação dental (Dental cryo-preservation). Resultados: Verificou-se que as células-tronco de ori-gem dentária parecem manter suas características biológicas, como a taxa de viabilidade, proliferação celular e ampla capacidade de di-ferenciação mesmo após a criopreservação. Além disso, a criopre-servação magnética apresenta-se como um protocolo promissor para a conservação de células-tronco dentárias. Conclusão: A criopre-servação é uma técnica eficaz para o armazenamento a longo prazo de células-tronco derivadas de tecidos dentários. Entretanto, estudos adicionais devem ser realizados em busca do desenvolvimento de protocolos de criopreservação mais padronizados e seguros que não afetem as propriedades biológicas das células-tronco dentárias.

Introduction: Dental tissues are an accessible source of mesenchymal stem cells that can be useful for the treatment of various clinical diseases. Thus, the interest and the need to ensure an efficient way to preserve stem cells of dental origin for future applications led to the development of cryopreservation methods, a technique by which low temperatures are applied to reverse, in a reversible and controlled manner, biological functions of living cells and tissues. Objective: To perform a literature review about the cryopreservation of stem cells of dental origin, emphasizing characteristics, principles, existing protocols, and effects of this method on the biological properties of these cells. Methodology: This study consisted of a literature review based on information from 54 scientific articles published between 2005 and 2019 and consulted in online databases (PubMed, SciELO, and Google Scholar), using the following descriptors: Cryopreservation, Dental stem cells, and Dental cryopreservation. Results: Stem cells of dental origin seem to maintain their biological characteristics, such as viability rate, cell proliferation, and ample capacity for differentiation even after cryopreservation. Also, magnetic cryopreservation presents itself as a promising protocol for the conservation of dental stem cells. Conclusion: Cryopreservation is an effective technique for the long-term storage of stem cells derived from dental tissues. However, additional studies should be carried out to develop more standardized and safer cryopreservation protocols that do not affect the biological properties of dental stem cells.

Monitorização de células-tronco mesenquimais injetadas via retrobulbar próximas ao nervo óptico lesados de coelhos / Monitoring of stem cells from adipose tissue injected via retrobulbar next to previously injured optic nerve of rabbits

Resumo Objetivo: Verificar a presença das células-tronco mesenquimais (MSC) na área próxima ao nervo óptico de coelhos previamente lesado com álcool absoluto. Métodos: Os 12 coelhos da raça Nova Zelândia foram distribuídos em 2 lotes. Após sedação, cada olho do animal recebeu uma injeção retrobulbar de 1 ml de álcool absoluto em um dos olhos e de 1 ml de solução fisiológica 0,9% (SF) no olho contralateral. Após 15 dias deste procedimento inicial todos os olhos dos animais pertencentes ao lote A, receberam via retrobulbar, uma solução contendo MSC de tecido adiposo humano e previamente marcadas com Qdots,. Todos os olhos dos animais do lote B receberam solução PBS. Resultados: Após 15 dias desta última aplicação os animais foram sacrificados e as lâminas foram analisadas. A presença das MSC foi observada em 100% dos olhos dos animais do lote A. Conclusão: Os resultados sugerem que a marcação prévia das MSC com Qdots permitiu o acompanhamento das mesmas na região aplicada e em áreas mais internas do nervo óptico. A permanência de MSC após 15 dias de aplicação ao redor do nervo óptico sugere a viabilidade e possível participação das mesmas no processo de regeneração do tecido lesado. Nas condições deste estudo, a via de aplicação retrobulbar permitiu a mobilização das células tronco do local de aplicação até áreas centrais dos nervos ópticos nos animais do lote A, sugerindo que esta poderá ser uma via de acesso eficaz para as MSC no processo de regeneração de neuropatias ópticas.

Abstract Obtective: To verify the presence of mesenchymal stem cells (MSC) in the area close to the optic nerve of previously injured with absolute alcohol. Methods: Twelve New Zealand breed rabbits were divided into two groups, and after sedation, each eye of the animal received a retrobulbar injection of 1 ml of absolute ethanol in one eye, and 1 ml of physiological solution 0.9 % (PS) in the contralateral eye. After 15 days all eyes of animals belonging to group A, received via retrobulbar a solution containing MSCs from human adipose tissue (AT) and previously marked with Qdots, while all eyes of animals from group B received solution containing PBS. Results: The presence of MSC was observed in 100% of the eyes of the animals of group A and the more central areas near and into the optic nerve. Conclusion: The results suggest that the appointment of MSC with Qdots allowed their follow-up applied in the region and in the inner areas of the optic nerve. The MSC permanence after 15 days of application around the optic nerve suggests the feasibility and possible involvement of the same during the damaged tissue regeneration process. Under the conditions of this study, the route of retrobulbar application and the presence of the stem cells to the central areas of the optic nerves in animals of group A, suggests that this might be an effective approach for MSCs in regeneration process of optic neuropathies.

Bone marrow mononuclear cells versus mesenchymal stem cells from adipose tissue on bone healing in an Old World primate: can this be extrapolated to humans? / Células mononucleares de medula óssea versus células-tronco mesenquimais de tecido adiposo em cicatrização de lesão óssea em primata: pode ser extrapolado para humanos?

In veterinary medicine, the cell therapy is still unexplored and there are many unanswered questions that researchers tend to extrapolate to humans in an attempt to treat certain injuries. Investigating this subject in nonhuman primates turns out to be an unparalleled opportunity to better understand the dynamics of stem cells against some diseases. Thus, we aimed to compare the efficiency of bone marrow mononuclear cells (BMMCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) from adipose tissue of Chlorocebus aethiops in induced bone injury. Ten animals were used, male adults subjected, to bone injury the iliac crests. The MSCs were isolated by and cultured. In an autologous manner, the BMMCs were infused in the right iliac crest, and MSCs from adipose tissue in the left iliac crest. After 4.8 months, the right iliac crests fully reconstructed, while left iliac crest continued to have obvious bone defects for up to 5.8 months after cell infusion. The best option for treatment of injuries with bone tissue loss in old world primates is to use autologous MSCs from adipose tissue, suggesting we can extrapolate the results to humans, since there is phylogenetic proximity between species.(AU)

Na medicina veterinária, a terapia celular ainda é inexplorada e há muitas perguntas não respondidas, o que leva os pesquisadores a uma tendência a estender a terapia para os seres humanos, na tentativa de tratar certas lesões. Investigar esse assunto em primatas não humanos revela-se uma oportunidade sem precedentes para compreender melhor a dinâmica das células-tronco contra algumas doenças. Assim, objetivou-se comparar a eficiência das células mononucleares de medula óssea (BMMCs) e das células-tronco mesenquimais (MSCs) do tecido adiposo de Chlorocebus aetiops na lesão óssea induzida. Foram utilizados 10 animais, adultos do sexo masculino, submetidos à lesão óssea nas cristas ilíacas. As MSCs foram isoladas e cultivadas; de forma autóloga, as BMMCs foram infundidas na crista ilíaca direita e as MSCs de tecido adiposo na crista ilíaca esquerda. Após 4,8 meses, a crista ilíaca direita foi totalmente reconstruída, enquanto a crista ilíaca esquerda continuou apresentando defeito ósseo evidente por até 5,8 meses após a infusão. A melhor opção para o tratamento de lesões com perda de tecido ósseo em primatas do Velho Mundo é a utilização de MSCs autólogas de tecido adiposo, sugerindo que se podem estender os resultados para seres humanos, uma vez que há proximidade filogenética entre as espécies.(AU)

Transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cells in refractory crohn's disease: systematic review / Transplante de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo na doença de crohn refratária: revisão sistemática

ABSTRACT Background: Crohn's disease is a pathological condition that has different options of treatment, but there are patients who need other therapeutic approach, such as the use of adipose-derived mesenchymal stem cells. Aim: Systematic literature review to determine the different ways of adipose-derived mesenchymal stem cells administration in humans with luminal refractory and perianal fistulizing Crohn's disease. Methods: It was conducted a search for articles (from 2008 to 2018) on PubMed and ScienceDirect databases using the keywords Crohn's disease, fistulizing Crohn's disease, luminal Crohn's disease and transplantation of mesenchymal stem cells or mesenchymal stem cells or stromal cells. Thirteen publications were selected for analysis. Results: Only one study referred to the luminal Crohn´s disease. The number of cells administered was variable, occurring mainly through subcutaneous adipose tissue by liposuction. It could be highlighted the autologous transplant with exclusive infusion of mesenchymal stem cells. The procedures involved in pre-transplant were mainly curettage, setons placement and stitching with absorbable suture, and conducting tests and drug treatment for luminal Crohn´s disease. During transplant, the injection of mesenchymal stem cells across the fistula path during the transplant was mainly on the intestinal tract wall. Conclusion: Although the use of mesenchymal stem cells is promising, the transplant on the luminal region should be more investigated. The injection of mesenchymal stem cells, exclusively, is more explored when compared to treatment with other products. The preparation of the fistulizing tract and the location of cell transplantation involve standardized health care in most studies.

RESUMO Racional: Há diferentes opções de tratamento para a doença de Crohn, porém, em alguns casos, há a necessidade de outras abordagens terapêuticas, como o uso de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo. Objetivo: Revisar sistematicamente a literatura para determinar as diferentes formas de administração das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo em seres humanos com doença de Crohn refratária luminal e fistulizante perianal. Método: Buscaram-se artigos publicados entre 2008 e 2018 nas bases de dados PubMed e ScienceDirect, pelos descritores: Crohn's disease, fistulizing Crohns disease, luminal Crohns disease e transplantation of mesenchymal stem cells ou mesenchymal stem cell ou stromal cells. Treze artigos foram selecionados. Resultados: Somente um trabalho se referiu à doença luminal. A quantidade de células administradas foi variável, obtendo-se principalmente do tecido adiposo subcutâneo por lipoaspiração. Destacou-se o transplante autólogo com a infusão exclusiva de células-tronco mesenquimais. Os procedimentos realizados no pré-transplante foram principalmente o de curetagem, colocação de setons e suturas com fio absorvível, e de exames e tratamento medicamentoso para a doença luminal. No transplante, ocorreu a injeção das células por todo o trajeto fistuloso, principalmente nas paredes do trato. Conclusão: Embora o uso de células-tronco mesenquimais seja promissor, o transplante na região luminal deve ser mais investigado. A injeção exclusiva de células-tronco mesenquimais é mais explorada quando comparada ao tratamento conjunto com outros produtos. A forma de preparo do trato fistuloso e o local de transplante envolvem cuidados médicos padronizados na maioria dos estudos.

Efeito do laser de baixa intensidade na atividade biológica de células-tronco do ligamento periodontal humano cultivadas sobre arcabouços de quitosana / Effect of low-intensity laser on the biological activity of human periodontal ligament stem cells cultured on chitosan scaffolds

O laser de baixa intensidade (LBI) é capaz de estimular a proliferação de diferentes tipos celulares, porém pouco se sabe sobre sua eficácia na proliferação de células cultivadas na superfície dos biomateriais. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do LBI na proliferação e viabilidade de células-tronco do ligamento periodontal humano (PDLSCs) cultivadas em arcabouços de quitosana. A quitosana foi submetida a testes para identificação do teor real de massa e grau de desacetilação. Membranas de quitosana foram preparadas pela técnica de evaporação de solvente e submetidas a caracterização de morfologia e de superfície. PDLSCs previamente isoladas e caracterizadas foram cultivadas sobre quatro superfícies: (P) plástico da placa de cultivo, não irradiado, como controle positivo de crescimento celular; (Q) quitosana, não irradiado; (L1) quitosana, irradiado com dose de 1 J/cm²; e (L4) quitosana, irradiado com 4 J/cm². As irradiações foram realizadas com laser diodo InGaAlP, com comprimento de onda de 660 nm, potência de 30 Mw, diâmetro da ponta de 0.01cm² e modo de ação contínuo, em dose única. Os dados mostraram que a quitosana apresentou um teor real de massa de 88,08% e grau de desacetilação de 91,37±3,77%. A análise das membranas por MEV mostrou superfície uniforme e homogênea, com espessura média de 68,71 µm. A análise por microscopia de força atômica revelou uma rugosidade média de 285 nm. O peso das membranas variou de 0,03 a 0,04 g, indicando a sua uniformidade, e o pH de superfície exibiu média de 6,9±0,25, valor próximo ao pH da saliva. A viabilidade e a proliferação celular foram avaliadas através dos ensaios de Alamar Blue, Live/Dead, Annexin V/PI e Ki67, além da análise do ciclo celular, e a morfologia celular foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). O ensaio do Alamar Blue mostrou diferenças significativas na atividade mitocondrial entre os grupos nos intervalos de 24 h (L1>Q, p= 0,0118) e em 48 h (L1>Q, p= 0,0022; L4>Q, p=0,0002; L4>L1, p= 0,0022). O ensaio Live/Dead mostrou maior densidade de células vivas nos grupos irradiados (L1 e L4) em relação ao grupo sem irradiação (Q), o que foi comprovado pelo ensaio da Annexin V/PI, que mostrou um maior percentual de células viáveis em L4 (89,5%) e L1 (87,0%) em comparação com Q (78,4%) em 72 h. A imunoexpressão da proteína Ki67 foi maior em L4 e L1 e estes dois grupos apresentaram também um maior percentual de células nas fases proliferativas do ciclo celular (S e G2/M). A análise por MEV mostrou no grupo Q células com morfologia mais arredondada e com poucas projeções, além de debris celulares, enquanto nos grupos irradiados as células exibiram um arranjo mais plano, com projeções mais distribuídas e pontos de adesão focal, especialmente em L4. Em conjunto, os resultados do presente trabalho permitem concluir que a laserterapia nos padrões estudados, especialmente na dose de 4 J/cm², influencia positivamente a viabilidade e a proliferação de PDLSCs em membranas de quitosana, permitindo assim que as células superem eventuais efeitos adversos do microambiente do arcabouço (AU).

Low-level laser irradiation (LLLI) is able to stimulate the proliferation of various cell types, but little is known about its effectiveness on the proliferation of cells cultured on biomaterial surfaces. The aim of this study was to evaluate the influence of LLLI on the proliferation and viability of human periodontal ligament stem cells (PDLSCs) cultured on chitosan scaffolds. Chitosan was submitted to tests to identify the real mass content and degree of deacetylation. Chitosan membranes were prepared by solvent evaporation technique and submitted to morphology and surface characterization. PDLSCs previously isolated and characterized were grown on the surfaces of four groups: (P) culture plate plastic, non-irradiated, as a positive control of cell growth; (C) chitosan, non-irradiated; (L1) chitosan irradiated with a dose of 1 J/cm²; and (L4) chitosan, irradiated with 4 J/cm². The irradiations were performed with InGaAlP diode laser with wavelength of 660 nm, power 30 mW, tip diameter of 0.01cm², and continuous action mode in a single dose. Cell viability and proliferation were evaluated by Alamar Blue, Live/Dead, Annexin V/PI and Ki67 assays, as well as cell cycle analysis, whereas cell morphology was evaluated by MEV. The data showed that the chitosan presented a real mass content of 88.08% and degree of deacetylation of 91.37 ± 3.77%. SEM analysis showed membranes with uniform and homogeneous surface, with a mean thickness of 68.71 µm. Analysis by AFM revealed roughness around 285 nm. The weight of the membranes ranged from 0.03 to 0.04 g, indicating their uniformity, and the surface pH exhibited a mean of 6.9 ± 0.25, a value close to the pH of the saliva. The Alamar Blue assay showed significant differences in mitochondrial activity between groups at 24 h (L1> C, p = 0.0118) and at 48 h (L1> C, p = 0.0022; L4> C, p = 0.0002; L4>L1, p = 0.0022). The Live/Dead assay showed higher density of live cells in irradiated groups (L1 and L4) compared to the group without irradiation (C), which was confirmed by assay of Annexin V/PI, which showed a greater percentage of viable cells in L4 (89.5%) and L1 (87.0%) compared to C (78.4%) at 72 h. The Ki67 immunoexpression was higher in L4 and L1 and these two groups also showed a higher percentage of cells in the proliferative phases of the cell cycle (S and G2/M). The SEM analysis showed in group C cells with more rounded morphology and with few projections, as well as cell debris, whereas in the irradiated groups the cells exhibited a more flat arrangement, more distributed projections and focal adhesion points, especially in L4. Taken together, the results of the present study shown that laser therapy in the studied patterns, especially at the dose of 4 J/cm², has a positive effect on viability and proliferation of PDLSCs on chitosan membranes, thereby allowing the cells to overcome any adverse effects of the scaffold microenvironment (AU).

Papel dos receptores ß1 e ß2 adrenérgicos sobre a diferenciação osteoblástica de células mesenquimais estromais da medula óssea de ratos espontaneamente hipertensos / Role of ß1 and ß2 adrenergic receptor on bone marrow mesenquimal stem cells osteoblastic differentiation from hypertensive rats

Introdução: O remodelamento ósseo é um processo complexo que depende do balanço entre formação e reabsorção óssea, mecanismo regulado pelas células ósseas e fatores sistêmicos, como o Sistema Nervoso Simpático (SNS). Os mediadores deste sistema são capazes de regular o metabolismo ósseo através dos receptores adrenérgicos expressos na superfície dos osteoblastos. Entretanto, o papel dos receptores ß-adrenérgicos ainda não está totalmente elucidado no processo de diferenciação osteogênica. Objetivos: avaliar o papel dos receptores ß-adrenérgicos na diferenciação osteoblástica de células tronco mesenquimais da medula óssea de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos (SHR). Métodos: Ratos machos Wistar e SHR (10 semanas) foram utilizados para a coleta da medula óssea a partir do fêmur, as quais foram plaqueadas em garrafas de cultivo celular e depois em placas de 24 poços, onde receberam o meio osteogênico (MO: MEM, mais 50 µg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de ß-glicerofosfato e 10-8 M de dexametasona), e o tratamento com Isoprenalina (0,01 µM), Carvedilol (1 µM), antagonista adrenérgico não seletivo, ou Nebivolol (0,1 µM), antagonista ß1-adrenérgico. O ensaio de proliferação celular (MTT) e a atividade de fosfatase alcalina (Fal) foram realizados nos dias 7, 10 e 14. A mineralização foi avaliada no dia 14 através do vermelho de Alizarina. A expressão gênica dos marcadores osteogênicos e dos receptores ß1 e ß2 adrenérgicos foi avaliada no dia 7 por RT-PCR em tempo real. A atividade proteolítica da metaloproteinase de matriz (MMP-2) foi avaliada no mesmo período utilizando zimografia. As vias da MAPK também foram avaliadas ao final de 7 dias. Resultados: A Isoprenalina reduz a fosfatase alcalina na linhagem de células Wistar nos dois primeiros períodos, e ao final de 14 dias apresenta um aumento significativo. A adição dos -bloqueadores reverte tal resposta. Em SHR a Isoprenalina proporciona aumento da atividade de fosfatase alcalina no período intermediário. O Nebivolol inibe essa resposta no mesmo período e, em 7 dias, é capaz de reverter a redução causada pelo agonista. A Isoprenalina aumentou a expressão de todos os fatores de transcrição e o bloqueio dos receptores reverteu essa condição A Isoprenalina aumenta a expressão de Opn, Ocn e BSP nas células de animais Wistar, e em SHR aumenta apenas Ocn e o tratamento com Carvedilol corrige. A atividade de MMP-2 também foi reduzida pelo Nebivolol apenas no grupo Wistar. Além disso, o Nebivolol reduziu a expressão gênica do receptor ß1-adrenérgico. O ensaio de mineralização mostrou menor deposição mineral em Wistar. O Nebivolol também mediou a redução da fosforilação das vias da MAPK neste mesmo grupo de células. Conclusão: Nossos dados sugerem que o receptor ß1-adrenérgico pode estar envolvido na diferenciação osteogênica de células de ratos Wistar mas não em células de ratos SHR(AU)

Introduction: Bone remodeling is a complex process that depends on the balance between formation and resorption bone, a process which is regulated by bone cells and systemic factors, like the Sympathetic Nervous system (SNS). The mediators of these system are able to regulate bone metabolism through adrenergic receptors on the surface os the osteoblastos. However, the role of ß-adrenergic receptors is not clear in he osteogenic differentiation process. Thus, in this study we aimed to evaluate the role of B-adrenergic receptor on osteoblastic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from normotensive and Spontaneously Hypertensive Rats (SHR). Methods: 70-days-old male Wistar and SHR rats were used for bone marrow collection from femurs, which was placed in cell culture flasks and after in to 24-well plates, where they received osteogenic medium (OM: MEN, plus 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM ß glycerophosphate, and 10-8 M dexamethasone) and the treatment with Isoprenaline (0.01 µM), Carvedilol (1µM), non-selective adrenergic receptor antagonist, or Nebivolol (0,1 µM), ß1-adrenergic receptor antagonist. Cell proliferation (MTT assay) and alkaline phosphatase specific activity (Alp) were analyzed at day 7, 10 and 14. Mineralization was evaluated at day 14, by Alizarin Red S. Gene expression of osteogenic markers and B1 and B2-adrenergic receptor were evaluated at day 7, by real time-RT-PCR. The proteolytic activity of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) were evaluated at day 7 using gelatin zymography. The MAPK pathway was evaluated at the same period. Results: Isoprenaline provides increased alkaline phosphatase activity in the intermediate period. The addition of Nebivolol includes this response over this same period and, within 7 days, was able to reverse the reduced agonist reduction. Isoprenaline increased expression of all transcription factors and receptor blockade reversed this condition Isoprenaline increases expression of Opn, Ocn and BSP in Wistar animal cells, and in SHR only increases Ocn and Carvedilol-corrected treatment. MMP-2 was reduced by Nebivolol treatment just at Wistar cells. Besides that, Nebivolol reduced Adrb1 gene expression at day 7 in Wistar group. Mineralization showed that Nebivolol reduced mineral deposition in Wistar. Nebivolol reduced MAPK proteins phosphorylation. Conclusion: Our results suggest that ß1 adrenergic receptor seems to be involved in the osteogenic differentiation of cells from Wistar rats but not in SHR cells(AU)

Expression patterns of mesenchymal stem cell-specific proteins in adipose tissue-derived cells: possible immunosuppressing agent in partial allograft for restoring the urinary bladder in rabbits / Padrão de expressão de proteínas específicas das células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo: possível agente imunossupressor em aloenxerto parcial para restauração de vesícula urinária de coelhos

Adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) are an attractive source of mesenchymal stem cells (MSCs) for use in tissue engineering and clinical applications. This paper focuses on the characterization of ADSCs used as immunosuppressive agent in rabbits undergoing partial allograft for urine bladder restorage. For this study highlighted the characterization of the ADSCs used as immunosuppressive agents in rabbits submitted to partial allograft for restoration of the urinary vesicle, using 25 animals, six months old, New Zealand. ADSCs at the third peal were characterized by the MSC-specific CD105, CD73 and CD90 expression and by the absence of the hematopoietic marker CD45, as revealed by flow cytometry analysis. Moreover, ADSCs were efficient in preventing allograft rejection from the urinary bladder, as judged by biochemical, clinical and ultrasonography analysis. Together, these results compose characterization of protein expression profiles and immunosuppressive functionality of ADSCs in rabbits, which had undergone partial allografts of the urinary bladder, foreseeing future applications in clinical practice.(AU)

As células mesenquimais derivadas de tecido adiposo (ADSCs) são uma fonte atraente de células-tronco mesenquimais (MSCs) para uso na engenharia de tecidos e suas aplicações clínicas. Este trabalho destacou a caracterização das ADSCs utilizadas como agentes imunossupressores em coelhos submetidos a aloenxerto parcial para restauração da vesícula urinária, sendo utilizados 25 animais, de seis meses de idade, Nova Zelândia. As ADSCs, após o terceiro repique, foram caracterizadas pela expressão específica de MSC CD105, CD73 e CD90 e pela ausência do marcador hematopoiético CD45, tal como revelado por análise de citometria de fluxo. Além disso, os ADSCs foram eficientes na prevenção da rejeição de aloenxertos da vesícula urinária, conforme avaliado por análises clínica, bioquímica e ultrassonográfica. Juntos, esses resultados compõem a caracterização dos perfis de expressão proteica e a funcionalidade imunossupressora de ADSCs em coelhos, que sofreram aloenxertos parciais da bexiga, prevendo futuras aplicações na prática clínica.(AU)

Evaluation of different commercial hyaluronic acids as a vehicle for injection of human adipose-derived mesenchymal stem cells / Avaliação de diferentes ácidos hialurônicos comerciais como veículo de injeção para células mesenquimais humanas derivadas do tecido adiposo

ABSTRACT Objective: The main purpose of this study is to evaluate, in vitro, the cytotoxicity of different commercial brands of hyaluronic acids to be used as a vehicle for injection of human adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSCs). Methods: AD-MSCs were divided into seven groups: one control group where AD-MSCs were cultivated with phosphate-buffered saline (PBS) and six other groups where AD-MSCs were cultivated with different commercial brands of hyaluronic acid. AD-MSC viability analysis was performed after 4, 24, and 48 h in contact with each treatment, using the trypan staining method on a Countess automated cell counter (Thermo Fisher Scientific). Results: The results clearly demonstrated a significant difference in cell viability when AD-MSCs were exposed to different hyaluronic acids when compared with the control group. Conclusion: These data suggest that hyaluronic acid can be used as a vehicle for injection of human AD-MSCs, but caution is needed to choose the best product, aiming at its future therapeutic application.

RESUMO Objetivo: Avaliar in vitro, de forma direta, a citotoxicidade de ácidos hialurônicos como veículo de injeção para linhagens de células-tronco mesenquimais (CTMs) obtidas de tecido adiposo humano. Métodos: As CTMs foram divididas em sete grupos, os quais foram expostos ao ácido hialurônico de seis marcas comerciais, além do contato com tampão fosfato-salino PBS (grupo controle). Após quatro, 24 e 48 horas, foi feita a análise da viabilidade celular através do contador Countess pelo método de coloração com Trypan Blue (Thermo Fisher Scientific). Resultados: Os resultados demonstraram uma diferença significativa na viabilidade celular quando essas linhagens de CTMs foram expostas aos diferentes ácidos hialurônicos em comparação com o grupo controle. Conclusão: Os dados sugerem que o ácido hialurônico pode ser usado como veículo de injeção para CTMs, porém é necessária cautela na escolha do melhor produto para aplicação terapêutica futura.

Allogenic mesenchymal stem cell intravenous infusion in reparation of mild intestinal ischemia/reperfusion injury in New Zealand rabbits / Infusão intravenosa de células tronco mesenquimais alógenas na reparação da lesão branda de isquemia/reperfusão intestinal em coelhos Nova Zelândia

The present study aimed to evaluate the efficacy of mesenchymal stem cell (MSC) infusion, derived from adipose tissue, on reduction of local and remote tissue damage caused by the event of experimental intestinal I/R in New Zealand breed rabbits. For obtaining, characterization, and cultivation of MSC derived from adipose tissue (MSC-Adp), 3 juvenile animals (four months old) were used. The cells were considered to be viable for therapy after the fourth passage (in vitro phase). For the in vivo stage, 24 young adult animals (six months old) were used, weighing approximately 3.5 kg, in which were randomly divided into two groups, called: IR treated with MSC (I2H/R5H MSC 3D; I2H/R5H MSC 7D); IR treated with PBS (I2H/R5H PBS 3D; I2H/R5H PBS 7D). The animals were anesthetized and submitted to pre-retro-umbilical midline celiotomy. The extramural peri-intestinal marginal artery was located and clamped (predetermined and standardized region) with the aid of a vascular clip, promoting a 2 hour blood flow interruption. After this period, blood flow was reestablished, inhalatory anesthesia was suspended, and the animals awaken. After 5 hours of reperfusion, the treatments were performed by intravenous infusion according to the experimental groups. The animals were evaluated 72 hours and seven days after the treatment as for the macroscopic appearance (color and peristaltism) of the jejunal segment, and by histological evaluation of the ischemic segment for the presence or absence of destruction of the intestinal mucosa, edema, bleeding, dilation of lymph vessels, and presence of polymorphonuclear inflammatory cells, both in the mucosa and submucosa. The observed results revealed that the groups treated with MSC-Adp obtained smaller mucosal and submucosal lesions when compared to the groups treated with PBS. Also, MSC-Adp treated groups obtained controlled inflammatory response and higher mitotic rate, outcomes related to the therapeutic potential of MSC. Infusion of stem cells attenuated the lesions caused by intestinal I/R in both MSC groups when compared to the group treated with PBS.(AU)

O presente estudo teve como principal objetivo avaliar a eficácia da infusão células tronco mesenquimais (CTM) derivada de tecido adiposo sobre diminuição das lesões teciduais locais e remotas, causadas pelo evento de I/R intestinal experimental, em coelhos da raça Nova Zelândia. Para obtenção, cultivo e caracterização das CTM provenientes de tecido adiposo (ADCTM) foram utilizados 3 animais jovens. As células foram consideradas viáveis para terapia a partir da quarta passagem (fase in vitro). Para etapa in vivo foram utilizados 24 animais, adulto-jovens, pesando aproximadamente 3,5kg, divididos aleatoriamente em dois grupos experimentais, denominados IR Tratado com CTM (I2H/R5H CTM 3D; I2H/R5H CTM 7D); IR Tratado PBS (I2H/R5H PBS 3D; I2H/R5H PBS 7D). Os animais foram anestesiados e submetidos à celiotomia mediana pré-retroumbilical. A artéria marginal peri-intestinal extramural foi localizada e clampeada (região predeterminada e padronizada) com auxílio de um clipe vascular, promovendo uma interrupção do fluxo sanguíneo durante 2 horas. Após esse período, o fluxo sanguíneo foi restabelecido, a anestesia inalatória suspendida e os animais despertados. Após 5 horas de reperfusão realizou-se os tratamentos por infusão endovenosa, conforme grupos experimentais. Os animais foram avaliados 72 horas e sete dias após o tratamento quanto ao aspecto macroscópico (coloração e peristaltismo) do segmento jejunal e por meio de avaliação histológica do segmento isquemiado quanto à presença ou ausência de destruição de mucosa intestinal, edema, hemorragia, dilatação de vasos linfáticos e presença de células inflamatórias polimorfornucleares, tanto em mucosa quanto submucosa. Os resultados observados revelaram que os grupos tratados com ADCTM obtiveram menores lesões em mucosa e submucosa quando comprados aos grupos tratados com PBS. Ainda os grupos tratados com ADCTM obtiveram resposta inflamatória controlada e maior taxa mitótica, resultados relacionados ao potencial terapêutico das CTM.(AU)